Principios físico-químicos de la preservación en frío

Como decíamos anteriormente, la preservación en frío se basa en el hecho de que las reacciones químicas (metabólicas) ocurren más lentamente a medida que desciende la temperatura. Según esto, a temperaturas por debajo de -140 ºC toda actividad biológica se detiene. Sin embargo, también ocurre que antes de llegar a estas temperaturas la muestra en cuestión es incapaz de resistir el proceso de enfriamiento y muere.

Desde que se iniciaran hace 50 años los primeros experimentos de preservación en frío se ha avanzado mucho en el conocimiento de los procesos que tienen lugar cuando se enfría una muestra biológica consistente en un conjunto de células aisladas en suspensión (no tejidos ni órganos), sobre todo en células reproductoras. Esto ha permitido diseñar estrategias de conservación que consiguen que el frío no resulte particularmente dañino. En este caso, estas estrategias están basadas en la adición de agentes protectores (frente al frío) a la vez que en la optimización de las velocidades de enfriamiento y recalentamiento.

Grosso modo, la explicación última de los procesos físico-químicos que tienen lugar en una célula cuando se enfría se basa en la llamada hipótesis de los dos factores, desarrollada en 1963 por Peter Mazur [P. Mazur, 1963] y que esbozaremos seguidamente.

Una célula, a efectos de lo que ahora nos ocupa, es básicamente un pequeño saco que encierra una disolución de agua y sales. El "material" del que está hecho este "saco" es lo que se llama una membrana semipermeable, un tejido especial que sólo deja pasar el agua a través de él, pero no las sales que tiene disueltas, de ahí su nombre. Por ello, cuando el agua sale o entra en la célula la concentración de las sales disueltas aumenta o disminuye.

Bastan dos principios físicos para explicar lo que le ocurre a la célula mientras se enfría: el principio de ósmosis y el principio de descenso del punto de congelación.

El principio de ósmosis nos dice que cuando tenemos un saco (célula) semipermeable de este tipo sumergido en otra disolución salina, entonces el agua empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las disoluciones. O sea, si sumergimos la célula en una disolución de sales más concentrada que el interior celular, entonces el agua (y sólo el agua) sale de la célula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce de volumen. Si, por el contrario, sumergimos la célula en una disolución más diluida que el interior celular, entonces empezará a entrar agua dentro de la célula intentando diluir también la disolución salina de su interior; el resultado es que la célula se hincha.

El principio de descenso del punto de congelación nos dice que si tenemos agua pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0º C, sino por debajo de esta temperatura; a una temperatura tanto más baja cuanto más cantidad de sal hayamos disuelto en ella. Un ejemplo de este fenómeno, por todos conocidos, es el que se produce cuando evitamos el deterioro del radiador de nuestro automóvil al añadirle anticongelante.

Cuando tenemos un conjunto de células que queremos conservar en frío, inicialmente las células se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene una solución salina isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular. Cuando se empieza a enfriar este preparado, el frío alcanza antes la solución exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando aún no se ha formado hielo dentro de la célula. A medida que se forma el hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo (¡va convirtiéndose en hielo!). Al disminuir la cantidad de agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a salir agua de la célula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares.

Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a estar más concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua salga. Y es aquí cuando interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de congelación. Y es que al estar más concentrada la disolución salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras enfriemos poco a poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la célula para compensar las concentraciones salinas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro de la célula y descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formación del dañino hielo intracelular.

La no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de supervivencia celular. Y es que aunque no se forme hielo aparecen dos nuevos factores que perjudican gravemente a la célula. Por una parte está el hecho de que en cierto instante la concentración de sales dentro de la célula llega a ser tan alta que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales irreversibles. Estos dos factores son tanto o más perjudiciales que la formación de hielo intracelular. En la Fig. 1 se muestran de forma esquemática los tipos de daños según la velocidad de enfriamiento. Por ello, en los protocolos de preservación de células aisladas hay que enfriar a una velocidad que sea lo suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formación de hielo intracelular, pero a su vez, lo suficientemente rápida como para no producir una deshidratación excesiva que conlleve una destrucción irreversible de la estructura celular. Esto da lugar a que el perfil que aparece cuando representamos el porcentaje de células que sobreviven a un proceso de preservación en frío frente a la velocidad de enfriamiento sea típicamente el de una U invertida, tal como se muestra en la Fig. 2.

  Modelo de enfriamiento celular, Cryobiotech, criopreservación de órganos, Principios físico-químicos

Fig. 1. La formación de hielo comienza en el exterior celular (de -2º C a -5º C). Tras ello, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se pueden producir distintos resultados. A) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento, entonces NO se forma hielo dentro de la célula. Sin embargo las causas de la muerte celular vienen provocadas por una excesiva deshidratación de esta, que da lugar a una reducción de su volumen (en algunos casos irreversible). B) Si se enfría a una velocidad intermedia entonces sí se produce hielo intracelular, ya que la célula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto de congelación no llega a ser el necesario. C) Cuando se enfría a velocidades muy altas se produce vitrificación.

  Modelo de enfriamiento en distintos tipos de células, Cryobiotech, criopreservación de órganos, Principios físico-químicos

Figura 2. Supervivencia de los distintos tipos de células en función de la velocidad de enfriamiento. Se observa el típico comportamiento de U invertida en todas ellas. Como se explica en el texto, esto es debido a la llamada hipótesis de los dos factores (toxicidad-sobreenfriamiento) que hacen que sea necesario un compromiso entre la velocidad de enfriamiento y el grado de deshidratación celular..

Por último, y como hablamos al principio, hemos de aclarar que aunque la mayoría de los experimentos se han hecho en el régimen de velocidades de enfriamiento antes señalado, a veces existe la posibilidad de velocidades de enfriamiento de decenas de miles de grados por segundo. Estas velocidades tan altas consiguen la vitrificación, lo que conlleva la no formación de hielo a la vez que la no deshidratación celular. Aun cuando esta técnica no es en principio aplicable a un órgano (dada la conductividad térmica finita de este), si que ha podido ser implementada en unos casos muy concretos, comprobándose la validez de dicha hipótesis. El ejemplo por antonomasia es el del Saccharomyces Cerevisiae [F. Dumont et al., 2001]. En la Fig. 3 se muestra cómo a velocidades de enfriamiento del orden de 50.000 ºC/min se recobra de nuevo un alto porcentaje de supervivencia celular.

  Gráfico de supervivencia celular en función de la velocidad de enfriamiento, Modelo de enfriamiento celular, Cryobiotech, criopreservación de órganos, Principios físico-químicos

Figura 3. Resultados de la supervivencia de Saccharomyces Cerevisiae en función de las distintas velocidades de enriamiento. Se observa cómo, para muy altas velocidades es posible llegar a impedir la formación de hielo mediante vitrificación.

Comprendidos, al menos cualitativamente, los mecanismos que acompañan el enfriamiento de una célula, el siguiente reto es intentar aprovechar este conocimiento para diseñar estrategias de conservación que eviten la formación de hielo, y la toxicidad y las deformaciones extremas. Las estrategias diseñadas hasta la fecha y que han dado muy buen resultado en ciertos casos notables (óvulos, esperma, piel, huesos, etc...) se basan en la adición de crioprotectores (anticongelantes). Su función es doble. Por un lado al ser añadidos a la célula hacen que la solución interior esté más concentrada y por tanto sea más difícil de congelar (principio de descenso del punto de congelación). Por otro lado, las sales intracelulares no estarán tan concentradas, ya que ahora, además de estas, tendremos anticongelantes disueltos y por tanto la concentraciones salinas no llegan a niveles tan tóxicos como si estos anticongelantes no estuvieran presentes.

El éxito del proceso de preservación en frío depende de la capacidad para optimizar todos los parámetros puestos anteriormente de relieve: la velocidad de enfriamiento, la concentración de crioprotectores, el tipo de crioprotector a utilizar, el tiempo de almacenamiento, la temperatura última de almacenamiento, la forma de recuperación (recalentamiento), etc. Y para ello es fundamental explorar ciertos detalles relacionados tanto con la fisiología celular (permeabilidad al agua, a los crioprotectores, resistencia de la membrana celular, control del tamaño de sus poros, etc...) como con las propiedades físico-químicas de los crioprotectores (punto de congelación, viscosidad, toxicidad, etc...) .

En lo tocante a células aisladas, la situación actual es que se ha podido preservar con éxito un conjunto importante de tipos de celulares, pero aún existen otros muchos en los que por desconocimiento de parámetros tan importantes como la permeabilidad de la membrana, por ejemplo, los resultados son aún escasos.

En lo que se refiere a la conservación de tejidos y órganos, los principios de conservación en frío son los mismos que los aplicables al caso de células aisladas. Sin embargo, desde el punto de vista técnico aparece una dificultad añadida que hace que esta empresa sea aún más complicada: el hielo extracelular. El hielo extracelular, del que nos despreocupábamos en el caso de células aisladas, es ahora el principal problema. En el caso de células aisladas, cuando los cristales de hielo extracelular van creciendo, van desplazando a las células hacia los lugares que aún se encuentran libres de hielo. En el caso de un órgano, las células que lo componen no están libres, de forma que no se pueden reubicar. Así, estos cristales de hielo hacen las veces de auténticas lanzas que al crecer van rompiendo y des-estructurando todo el tejido u órgano en cuestión, destruyéndose irremisiblemente.

Por lo dicho en el párrafo anterior, lo conservación de tejidos y órganos en frío requiere eliminar la formación de hielo extracelular. Podría ingenuamente pensarse que la solución al problema está en la adición de agentes crioprotectores, tal y como se hace en el caso de células aisladas. Sin embargo aquí el problema es mucho más complejo, debido sobre todo a la conductividad térmica finita del órgano. Cuando se calcula la concentración de crioprotector necesaria para evitar la formación de hielo en el órgano se encuentra que está entorno a 8 molar, cantidad que resulta prohibitivamente tóxica para el caso de los crioprotectores convencionales. Pensamos que el problema debe ser atacado por distintos flancos. Por otro lado hemos de evitar los fuertes gradientes de temperatura cuando se enfría el órgano, lo que conlleva una perfusión por su sistema vascular. Además habrá que introducir el crioprotector de forma controlada, ya que este es tanto menos tóxico cuanto más frío esté el órgano. Para hacer un diseño óptimo de este protocolo resulta fundamental conocer de antemano el campo de temperaturas que presentará el órgano, ya que de otra forma la gran cantidad de parámetros experimentales haría imposible optimizar el proceso. Además, parece lógico que el diseño de crioprotectores de baja toxicidad, gran penetración y elevada temperatura de vitrificación ayudaría enormemente.

En el resto de esta memoria se desarrolla el proyecto que queremos elaborar.

Revisado: 14/02/2002 .

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